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qPCR (PCR quantitative) : de la théorie à la réalisation pratique
Objectifs
Programme
La formation est axée sur l’application de la technologie de la
PCR en temps réel (Real-Time PCR), avec un accent particulier
sur la pratique.
– Comprendre et appliquer les diverses techniques de
quantification des acides nucléiques ARN et ADN
– Acquérir les connaissances théoriques et pratiques permettant de
choisir la stratégie de PCR quantitative la mieux adaptée
aux contraintes expérimentales
– Avoir une vue d’ensemble des logiciels couramment utilisés
pour l’analyse des résultats.
Présentation des différents principes de la PCR quantitative
– Rappels sur les fondamentaux de la PCR quantitative, notion de
Cq, formats de fluorescence, méthodes de calcul de l’efficacité
– Mise au point d’une PCR quantitative : optimisation, validation,
plan d’expérience, stratégies de normalisation, dilutions etc.
– Calibration et droite d’étalonnage
Stratégies en PCR quantitative
– Méthode par quantification absolue (standard externe)
– Méthode par quantification relative avec et sans standard externe
– Normes MIQE
TRAVAUX DIRIGÉS
– Design et conception des amorces, choix des amorces, résolution
des problèmes de spécificité et de sensibilité
– Principes de la PCR relative, choix des gènes de normalisation
avec différents logiciels, suivi de la normalisation par la méthode
Δ Δ Ct
– Mise en place de la méthode par quantification absolue avec
sa gamme standard : extraction et purification d’ADN avec
différentes méthodes, contrôle du dosage et pureté, plan
de plaque, dilutions, établissement des standards, choix des
fluorochromes, qPCR et interprétation des résultats
– Réalisation de courbe de fusion et leur interprétation
– Détermination de l’efficacité des amorces :
– Méthode des dilutions en série et croisées,
– Utilisation du principe de gradient de température sur des
dilutions de standards
– Mise en place de la méthode par quantification relative avec
utilisation du Δ Δ Ct avec et sans gamme standard :
– Extraction et purification d’arn, contrôle du dosage et pureté,
reverse transcriptase, plan de plaque, choix des fluorochromes,
qPCR et interprétation des résultats
– Optimisation de l’ensemble des contrôles et surtout leur intérêt
(référence au MIQE)
– Principe de détection utilisé : SYBR (EVA) Green, sondes à
hydrolyse, Molecular Beacon
Public visé
Ingénieurs, techniciens.
Prérequis
Maîtriser les techniques de base de la biologie moléculaire
Méthodes pédagogiques
Enseignements : 40 %
Travaux pratiques : 60 %
Modalités d'évaluation
QCM, TD et TP.
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