qPCR ou PCR quantitative : de la théorie à la réalisation pratique

La formation est axée sur l’application de la technologie de la PCR en temps réel (Real-Time PCR), avec un accent particulier sur la pratique.

– Comprendre et appliquer les diverses techniques de quantification des acides nucléiques ARN et ADN

– Acquérir les connaissances théoriques et pratiques permettant de choisir la stratégie de PCR quantitative la mieux adaptée aux contraintes expérimentales

– Avoir une vue d’ensemble des logiciels couramment utilisés pour l’analyse des résultats.

LES MATINS : COURS ET TRAVAUX DIRIGÉS

Présentation des différents principes de la PCR quantitative 

– Rappels sur les fondamentaux de la PCR quantitative, notion de Cq, formats de fluorescence, méthodes de calcul de l’efficacité

– Mise au point d’une PCR quantitative : optimisation, validation, plan d’expérience, stratégies de normalisation, dilutions etc.

– Calibration et droite d’étalonnage

Stratégies en PCR quantitative

– Méthode par quantification absolue (standard externe)

– Méthode par quantification relative avec et sans standard externe

– Normes MIQE

TRAVAUX DIRIGÉS

– Design et conception des amorces, choix des amorces, résolution des problèmes de spécificité et de sensibilité

– Principes de la PCR relative, choix des gènes de normalisation avec différents logiciels, suivi de la normalisation par la méthode Δ Δ Ct

LES APRÈS-MIDI : LA PRATIQUE

– Mise en place de la méthode par quantification absolue avec sa gamme standard : extraction et purification d’ADN avec différentes méthodes, contrôle du dosage et pureté, plan de plaque, dilutions, établissement des standards, choix des fluorochromes, qPCR et interprétation des résultats

– Réalisation de courbe de fusion et leur interprétation

– Détermination de l’efficacité des amorces :

– Méthode des dilutions en série et croisées,

– Utilisation du principe de gradient de température sur des dilutions de standards

– Mise en place de la méthode par quantification relative avec utilisation du Δ Δ Ct avec et sans gamme standard :

– Extraction et purification d’arn, contrôle du dosage et pureté,

reverse transcriptase, plan de plaque, choix des fluorochromes, qPCR et interprétation des résultats

– Optimisation de l’ensemble des contrôles et surtout leur intérêt (référence au MIQE)

– Principe de détection utilisé : SYBR (EVA) Green, sondes à hydrolyse, Molecular Beacon