PCR Digitale - dPCR

– Comprendre et appliquer les diverses méthodes et techniques de quantification des acides nucléiques ARN et ADN

– Acquérir les connaissances théoriques et pratiques de la dPCR

– Quantification absolue

– Avoir une vue d’ensemble des logiciels couramment utilisés pour l’analyse des résultats

MATINS : COURS ET TRAVAUX DIRIGÉS

Rappel sur la technique de la qPCR

– Rappels sur les fondamentaux de la PCR quantitative, notion de Cq, formats de fluorescence, méthodes de calcul de l’efficacité

– Mise au point d’une PCR quantitative : Optimisation, Validation, Plan d’expérience

– Stratégies de Normalisation, Dilutions etc.

– Calibration et droite d’étalonnage

Présentation de la technique de la dPCR :

– Génération et partition en micro gouttelettes

– Préparation des échantillons

– Utilisation du système de fluidique

– Lecture par fluorescence

– Estimation de la quantification et concentration de la cible

– Correction de l’estimation avec la Loi Poisson et ses différents paramètres

Stratégies de la dPCR :

– Quantification absolue : détermination du nombre de copies d’un gène

– Variation du nombre de copies : CNV

– Détection d’un évènement rare : mutation rare avec détermination de l’abondance d’une mutation dans un mélange de cellules normales

– Quantification de pathogènes : virus, bactéries, parasites

– Expression gènique : intérêt pour visualiser de faibles variations d’expression

NORMES DIGITAL MIQE

Travaux dirigés :

– Design et conception des amorces, choix des amorces, résolution des problèmes de spécificité et de sensibilité

– Etude de cas et analyses de résultats à partir d’exemples

Après-midi : travaux pratiques

– Mise en place de la méthode de quantification absolue avec détermination du nombre de copies d’un gène et/ou quantification de pathogène : virus, bactéries, parasites ...

– Extraction et purification d’ADN avec différentes méthodes

– Contrôle du dosage et pureté

– Préparation des échantillons

– Plan de plaque

– Lecture par fluorescence

– Interprétation des résultats

– Mise en place de la méthode par expression génique avec pour intérêt la visualisation de faibles variations d’expression

– Extraction et purification d’ARN

– Contrôle du dosage et pureté

– Reverse transcriptase

– Préparation des échantillons

– Plan de plaque

– Lecture par fluorescence

– Interprétation des résultats

– Optimisation de l’ensemble des contrôles et leurs intérêts (référence au Digital MIQE)